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Post-translational modification(phosphorylation, acetylation, methylation등)을 확인하고자 할 때 샘플은 어떻게 준비하여야 하나요?

PTM 위치 분석을 수행하기 위해서는 각 단백질들의 전체 서열에 준하는 범위를 탐지하여야 하므로 대표 서열 한 두개의 탐지로 충분한 단백질 프로파일링 분석에 비해 많은 양의 단백질 시료가 요구됩니다.

분석 대상 단백질을 특정하고 계실 경우에는 해당 단백질이 1~2ug 정도 포함되도록 샘플을 준비해 주시면 됩니다. 1DE SDS-PAGE를 진행하여 coomassie staining을 처리 하였을 때 굵고 뚜렷한 밴드가 형성되는 수준이면 분석이 용이합니다.

Immunoprecipitation을 통해 단백질의 상호작용(binding partner)을 확인하고자 할 때 샘플은 어떻게 준비하여야 하나요?

IP 분석 과정 및 1DE 분석을 진행한 뒤에 target protein의 size 측정을 통해 탐지 여부를 우선 판단하여야 합니다. IP 진행 과정에서 condition에 따라 밴드가 관찰되지 않는 경우도 간혹 발생하므로 IP는 2~3번 정도 반복 진행하고 1DE 분석을 통해 재현성 있게 나타나는 밴드를 binding partner로 선정하는 것이 좋습니다. 일반적으로 binding partner는 target protein에 비해 상대적으로 미량인 경우가 많으므로 반복 실험을 통해 확인된 밴드들을 모두 하나의 tube에 모아 주시면 좋습니다.

샘플을 준비하시고 해당 샘플의 1DE gel 이미지를 촬영하시어 메일(최은영, choiey@proteomix.org)로 보내주시면 LC-MS 분석 가능 여부를 판단하여 안내 드립니다. 1DE gel 이미지 사진 발송 시 contrast 등의 임의 조정을 거치지 않은 원본으로 보내 주시기 바랍니다.

MALDI-TOF(/TOF)와 LC-MS는 어떠한 차이가 있나요?

MALDI-TOF 분석은 샘플에 존재하는 모든 peak들을 한꺼번에 탐지하기 때문에 샘플을 충분히 separation 하여야 좋은 결과를 얻으실 수 있습니다. 1DE 만을 거쳐서 하나의 밴드에 여러 단백질이 섞여 있는 경우에는 단백질이 제대로 탐지되지 않거나, 혹은 샘플 내 과량으로 존재하는 단백질들만이 불필요하게 탐지될 수 있습니다.

MALDI-TOF/TOF 과정에서는 MALDI-TOF 과정에서 탐지된 precursor ion을 한번 더 쪼개어 MS 분석을 수행하게 됩니다(MS/MS 또는 tandem MS). 일반적으로 MALDI-TOF에 비해 확실하고 정확한 펩타이드 분석을 수행할 수 있습니다. 이 과정에서는 MALDI-TOF를 우선 거친 뒤 상위 15~20개의 intensity peak들을 선별 후 다시 MS 분석을 수행하게 됩니다. 짧은 시간 안에 정확한 펩타이드 분석이 가능하므로 2DE 진행 후 얻은 spot을 분석하기에 용이합니다.

LC-MS는 샘플의 separation 부터 MS/MS 분석 과정을 30~40여 분에 걸쳐 진행하게 됩니다. MALDI-TOF(/TOF) 방식에 비해 분석 시간은 오래 소요되지만, 많은 단백질들이 섞여있는 복잡한 시료로부터 구성 단백질들을 대부분 탐지해낼 수 있으며 MALDI-TOF(/TOF)에 비해 좀 더 높은 단백질 서열 범위 탐지능을 가지고 있습니다.

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